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DNA-Sequenzierung


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DNA-Sequenzierung ist die Bestimmung der DNA-Sequenz also der Nukleotid -Abfolge von genomischer DNA . Auf diese Weise konnte seit 1995 Genom von über 150 verschiedenen Organismen entschlüsselt (s. Sequenzierte Organismen ).

Die Sequenzierung kann mit verschiedenen Methoden werden wobei es drei praktisch verwendbare Methoden Bestimmung der eigentlichen Nukleotidabfolge gibt. An die schließt sich in der Regel die DNA-Sequenzanalyse an.

Sequenzierung im großen Maßstab wie für Humangenom-Projekt stellte die bisher größte Herausforderung für Bioinformatik dar.

Inhaltsverzeichnis

Sequenzierungsmethoden

Maxam und Gilbert Methode

Die Methode der chemischen Spaltung nach und Gilbert ( 1977 ) diente ihren Erfindern zur erfolgreichen Bestimmung Operon -Sequenz eines Bakteriengenoms. Sie wurde vedrängt von zwar zeitgleich unabhängig entstandenen aber schnelleren und automatisierbaren

Didesoxymethode nach Sanger

Die Didesoxymethode wird auch "kontrollierte Unterbrechung enzymatischen Replikation" genannt und von Sanger um 1975 entwickelt und ebenfalls 1977 mit der vollständige Sequenzierung eines Genoms ( Bakteriophage φX174 [1] ) vorgestellt.

Man verwendet dazu heutzutage die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). In vier sonst gleiche Ansätze je eine unterschiedliche Base als Didesoxynukleotid (ddNTP) Ohne die Hydroxyfunktion ist eine DNA-Verlängerung durch nicht möglich und es kommt zum Kettenabbruch. die ddNTPs zufällig eingebaut werden bricht die an verschiedenen Stellen ab. Nach der PCR jeder Ansatz getrennt mittels Gelelektrophorese getrennt und man kann die Sequenz Hand des Gels ablesen.

Sequenzierung durch Hybridisierung

Zu diesem Zweck werden auf einem (DNA-Chip oder Microarray ) kurze DNA-Abschnitte ( Oligonukleotide ) in Matrix -Anordnung fixiert. Die Fragmente der zu sequenzierenden werden mit Farbstoffen markiert und das Fragmentgemisch auf der Oligonukleotidmatrix ausgebracht so dass komplementäre und freie DNA-Abschnitte miteinander hybridisieren können. Nach Auswaschen ungebundener Fragmente lässt sich das Hybridisierungsmuster der Farbmarkierungen und deren Intensität ablesen. Da Sequenzen der fixierten Oligonukleotide und deren Überlappungsbereiche sind kann man letztlich aus dem Farbmuster die zugrundeliegende Gesamtsequenz der unbekannten DNA rückschließen.

Hilfsmethoden

  • Shotgun-Sequenzierung
  • Chromosomal walks

Weblinks



Bücher zum Thema DNA-Sequenzierung

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